為推動NGS在血液腫瘤診療中的應用，提高診療水平，中國抗癌協(xié)會血液腫瘤專業(yè)委員會、中華醫(yī)學會血液學分會、中華醫(yī)學會病理學分會組織國內相關的血液、病理和檢驗專家，結合國外權威資料和已積累的大樣本數(shù)據，制訂了NGS在血液腫瘤中應用的中國專家共識。
文章來源丨中華血液雜志
二代測序技術在血液腫瘤中的應用
中國專家共識
中國抗癌協(xié)會血液腫瘤專業(yè)委員會, 中華醫(yī)學會血液學分會
中華醫(yī)學會病理學分會.
中華血液學雜志,2018,39( 11 ): 881-886.
血液腫瘤是一類具有高度異質性的疾病，其診療需要結合形態(tài)學、免疫學、遺傳學和分子生物學進行綜合分析。二代測序（Next-generation sequencing, NGS）作為新的分子生物學技術，具有通量高、靈敏度高、成本低等優(yōu)勢，是探索血液腫瘤的分子發(fā)病機制并指導臨床診療的重要手段。
血液腫瘤中常見的分子生物學異常主要包括基因突變、融合基因及基因異常表達。目前NGS在基因突變的檢測方面應用最為廣泛和成熟，本共識僅涉及基因突變的檢測。
一、NGS在血液腫瘤診療中的
應用價值
1
診斷分型：
基因突變的檢測在急性髓系白血病(AML)伴重現(xiàn)性遺傳學異常、遺傳易感性髓系腫瘤、骨髓增殖性腫瘤(MPN)、骨髓增生異常綜合征伴環(huán)形鐵粒幼紅細胞(MDS-RS)、毛細胞白血病(HCL)和淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥(LPL/WM)的診斷中具有關鍵性的作用，對于其他血液腫瘤則起到輔助診斷的作用。
2
預后判斷：
基因突變是各類血液腫瘤預后判斷的重要依據，目前NCCN指南已提出了基于基因突變的AML預后分層體系。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤(CLL/SLL)、LPL/WM、大顆粒淋巴細胞白血病(LGLL)中，已經證實了一些具有明確預后意義的突變基因。其他血液腫瘤中突變基因的預后意義尚有待于進一步研究。
3
指導治療：
一方面，基因突變檢測可提供分子治療靶點，對應靶向藥物進行治療，目前已有基于突變基因的靶向藥物應用于臨床或處于臨床試驗階段，其中FLT3、IDH1/2、BRAF及JAK-STAT信號通路相關的突變基因已有靶向藥物上市；另一方面，基因突變可以導致對某些藥物的敏感或者耐受，及時檢測有助于治療方案的調整。例如，TP53突變的CLL/SLL患者對常規(guī)化療反應差，MYD88和CXCR4基因突變可影響伊布替尼在LPL/WM中的治療效果，ABL1激酶區(qū)突變是慢性髓性白血病(CML)和Ph+ ALL酪氨酸激酶抑制劑(TKI)耐受的主要機制之一。
4
微小殘留病(MRD)監(jiān)測：
基因突變是MRD監(jiān)測的分子標志物之一。雖然實時定量PCR方法和流式細胞學是目前主流的MRD監(jiān)測方法，但是由于NGS靈敏度隨測序深度加深可進一步提高，在MRD監(jiān)測方面具有更大的優(yōu)勢。
5
克隆演變：
血液腫瘤在發(fā)展過程中會伴隨動態(tài)的克隆演變，或是基因突變負荷的改變，或是新的突變基因的出現(xiàn)，及時監(jiān)測基因改變，有助于了解疾病進展并調整治療方案。
二、基本流程
檢測的基因種類列表設計
1
檢測的基因：
血液腫瘤相關檢測基因由臨床血液腫瘤專家和實驗室專家共同制定，主要依據中國抗癌協(xié)會、中華醫(yī)學會、WHO、NCCN等機構發(fā)布的血液系統(tǒng)疾病診療指南或者專家共識。對于其他權威文獻報道的重要基因，可在驗證之后納入基因列表。血液腫瘤易感的胚系突變基因，根據檢測需求可以納入，例如CEBPA、DDX41、RUNX1、ETV6、GATA2等基因除了可發(fā)生體細胞突變外，發(fā)生胚系突變可導致髓系腫瘤的易感。檢測基因的數(shù)量應在滿足臨床需求的基礎上，綜合疾病類型、實驗技術、樣本數(shù)量以及檢測成本達到最優(yōu)化的設計。隨著基礎及臨床研究的不斷深入，檢測的基因種類亦需隨之更新。
2
檢測區(qū)域：
被檢測的基因所覆蓋區(qū)域可參考臨床診療指南、權威數(shù)據庫、文獻及實驗室自建數(shù)據庫等。首先應納入基因熱點突變區(qū)域或重要結構域的編碼區(qū)域，例如NPM1基因c.860_863為熱點突變區(qū)域，NOTCH1基因突變最多見于HD結構域及ΔPEST結構域；無明確熱點突變區(qū)域或突變位點分布比較分散的基因，應檢測全部外顯子，例如TP53、RUNX1等；剪接位點突變有可能導致外顯子跳躍，影響蛋白功能，建議根據數(shù)據庫記錄和文獻報道將剪接位點±5 bp的區(qū)域納入檢測范圍；對于存在非翻譯區(qū)（UTR）突變的基因，例如BCL6，則應納入相應區(qū)域檢測。需要注意的是，對于不能覆蓋的熱點突變類型或重要區(qū)域可通過其他檢測方法進行補充，并在檢測報告中明確說明。
實驗流程
1
樣本采集：
疑診為血液腫瘤的患者，初診時應留存新鮮骨髓、外周血或組織樣本，以備進行NGS檢測，未留存者可使用初診時的骨髓涂片進行檢測。骨髓采集量以1~3 ml為宜，外周血采集量3~5 ml為宜，若白細胞計數(shù)偏高或偏低，應適當調整采集量，使單個核細胞總數(shù)達到1×10^7以上?？鼓齽┦走xEDTA抗凝劑或枸櫞酸鈉抗凝劑，禁止使用肝素抗凝，推薦24 h內4 ℃冷藏運送。福爾馬林固定后的組織標本需選擇腫瘤成分，切片厚度8~10 µm，5~8片為宜，常溫運輸。已染色標本不推薦進行NGS檢測。條件允許的病例，可從同一患者采取正常組織作為胚系突變對照。
2
DNA提取：
DNA質量是NGS檢測成功的關鍵因素，同一患者的不同病灶組織、不同組織切片應分別單獨進行DNA提取，并對DNA質量進行評估，包括濃度、純度和完整性分析。由于FFPE組織標本以及骨髓涂片所提取的DNA易片段化，且因保存環(huán)境及保存時間不同，導致DNA片段化的程度參差不齊，因此各實驗室應具有相應的方法檢測DNA的完整性或降解程度，并設立明確的合格樣本標準。
3
文庫制備：
文庫制備用于目標區(qū)域的富集，主要有雜交捕獲法和擴增子建庫法，無論采用何種方法制備文庫，均需使用已驗證過的建庫試劑。多標本同時測序應有相應的分子標簽用于區(qū)分不同的測序標本，明確不同的檢測標本和分子標簽的一一對應關系；必要時，可對加標簽的方法及試劑進行說明。文庫濃度過高會導致多克隆數(shù)據的產生，降低有效測序數(shù)據量；過低會導致整體測序數(shù)據的減少，因此在測序之前推薦使用實時定量PCR或其他方法對文庫進行定量，將文庫濃度調整至合適的水平。每個檢測項目應設定其文庫質量的要求，并設立明確的合格文庫標準。
4
上機檢測：
目前測序主要有電位檢測和光學檢測兩種基本原理，檢測DNA合成過程中釋放的氫離子或熒光信號。為保證測序質量、檢測區(qū)域覆蓋深度及報告時效性，需要根據樣本數(shù)量和質量選取適當?shù)臏y序平臺和芯片。
生物信息學分析流程
1
質控分析：
由測序平臺產生的原始數(shù)據通常會存在堿基召回錯誤、插入刪除錯誤、低質量讀段(reads)及接頭污染等問題，會在一定程度上影響下游的分析過程。因此，在對測序結果進行具體的生物信息學分析之前，要先對下機數(shù)據進行質量評估，制定有效的質量控制標準，包括堿基的質量Q20、目標區(qū)域平均測序深度、均一性等評價參數(shù)。血液腫瘤的基因突變檢測，測序深度應≥500×，平均測序覆蓋度、均一性以及在靶率均≥90%。
2
數(shù)據過濾：
低質量讀段會影響下游的序列處理和分析，因此需要對測序數(shù)據進行過濾處理。數(shù)據過濾所針對的讀段主要有四種：測序質量低的讀段(low quality reads)，重復讀段(duplicate reads)，含有核苷酸的插入、刪除和替換等錯誤的讀段(insertion / deletion / mismatch)和帶有人工污染的讀段(adaptor)等。常用的數(shù)據過濾軟件有Trimmomatic、Fastx_toolkit、NGS QC Toolkit等。
3
序列比對：
當讀段經過質控與過濾等步驟達到一定的質量標準之后，需要將其比對到參考基因組上。目前普遍參考的人類基因組參考序列為Human hg19。不同的比對方法根據不同的比對策略設計了不同的算法，常用的比對程序軟件有MAQ、BWA、Bowtie/Bowtie2、SOAP/SOAP2、mrFAST和Stampy等，實驗室應當選取合適的比對軟件，建立完善的實驗室比對流程。
4
突變位點注釋：
突變位點識別常借助于Samtools、GATK等識別工具。對突變位點的注釋內容包括功能信息、頻率信息、軟件預測結果信息以及疾病數(shù)據庫信息，常用的包括Ensembl、RefSeq、GENCODE、dbSNP、1000genomes、ESP、ExAC、COSMIC、HGMD、Clinvar、polyphen和SIFT等。
5
突變位點篩選：
篩選與鑒別疾病相關突變位點需要經過嚴格的篩選流程，至少需要排除低質量變異、未有明確意義的非編碼區(qū)變異、同義單核苷酸變異（SNV）及已知健康人群中的基因多態(tài)性位點。
報告內容
1
基因信息：
報告中除患者信息、標本信息、送檢日期、報告署名及日期等一般資料外，還應包括：檢測基因列表、檢測區(qū)域及突變類型；使用的檢測平臺、目標區(qū)域的富集方法、平均測序深度、數(shù)據分析軟件名稱及版本號；對相關專業(yè)術語進行解釋說明；本實驗室報告突變位點的規(guī)則、檢測方法的局限性、檢測靈敏度和準確度等；注明是否通過其他方法補充了NGS未覆蓋或覆蓋不佳的檢測區(qū)域等。
2
突變位點的描述：
突變位點信息應該包括基因名稱、突變的物理坐標、cDNA的轉錄本號、外顯子位置、符合人類基因組變異協(xié)會(HGVS)書寫規(guī)范的突變類型、氨基酸突變類型、變異等位基因頻率以及該突變位點的測序深度等。參考序列推薦使用美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information)收錄的參考序列。當使用各基因編碼DNA參考序列描述突變時，推薦最常使用的經典轉錄本(canonical sequence)。
3
突變位點分級報告：
不推薦將良性或可能良性突變在報告中報道。建議突變位點根據臨床意義的明確性進行分級報告：
① 一級變異：具有明確臨床意義的突變，包括：國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)、美國食品藥品管理局(FDA)等機構批準的用藥治療靶點；血液腫瘤診療指南或專家共識中有明確診斷、治療、預后意義的突變；尚未進入診療指南或專家共識，但有權威文獻或大規(guī)模報道在血液腫瘤中具有診療意義的突變。
② 二級變異：具有潛在臨床意義的突變，包括：基于多個小規(guī)模研究報道在血液腫瘤中具有診斷、治療或預后意義，但尚未達成共識的突變；新發(fā)現(xiàn)的疾病相關基因重要結構域的體細胞突變。
③ 三級變異：臨床意義未明的突變，對于尚有爭議的突變位點，實驗室必須制定相關規(guī)則，可以發(fā)現(xiàn)突變即報告，并附上說明和意義；也可以不報告或只報告小部分突變結果，并附上說明、參考文獻及數(shù)據庫。
4
報告解讀：
突變位點的臨床意義解讀要平實客觀、清晰易懂。推薦寫明突變位點的人群突變頻率、蛋白功能危害性預測和疾病數(shù)據庫的記錄，根據疾病診療指南、專家共識和既往研究說明突變位點在臨床診斷、治療和預后評估中的意義，注明其相關藥物及正在開展的狀態(tài)信息，并附上數(shù)據庫和參考文獻來源。對于胚系突變，除了疾病診療指南及重要參考文獻外，推薦參考OMIM、HGMD和ACMG等數(shù)據庫或學術機構中遺傳疾病變異分類指導注釋臨床意義，并附上數(shù)據庫和參考文獻來源。陰性結果并不能完全排除患者不存在基因突變，可能是由于檢出靈敏度或檢測區(qū)域局限性所致，報告中應當以醫(yī)師可以理解的方式對此予以說明。
三、質量管理與控制
1
實驗室要求：
NGS檢測實驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實驗室建設指南（試行）》、《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》等行業(yè)文獻和要求。檢測人員、生物信息分析人員、報告分析人員和提供咨詢人員應具備相應專業(yè)背景且經過相應培訓取得上崗資質。實驗室區(qū)域設置和環(huán)境需要滿足實驗環(huán)節(jié)和儀器要求。NGS檢測試劑及測序平臺應首選CFDA認可的產品。涉及實驗室自配試劑、探針等，應該有嚴格的試劑制備標準操作規(guī)程（SOP），并經過臨床實驗室自建項目(LDT)驗證合格后方可使用
2
質量控制：
NGS實驗室應建立質量管理體系，對于標本采集和處理、實驗操作、生物信息分析和報告分析各個環(huán)節(jié)均需要建立SOP文件，實驗操作程序和生物信息分析須經過性能驗證或確認.
實驗環(huán)節(jié)需要設置陰/陽性對照。陽性對照一般采用包含已知突變信息的混合樣本作為質控材料，并且其中應當包含最低檢測限的突變位點，實驗時同時進行檢測，以確保其檢出能力。陰性對照一般采用明確無突變或無核酸的樣本作為質控材料，實驗時同時進行檢測，以確保實驗過程中無污染及無非特異性。
實驗室應定期參加相應檢測項目的室間質量評價或能力驗證；若無法實現(xiàn)，應通過與其他實驗室（如使用相同檢測系統(tǒng)的實驗室）比對的方式，判斷檢驗結果的可接受性。
樣本質量問題、檢測過程的不確定因素以及數(shù)據分析可能存在的漏洞，都可能導致檢測結果中存在假陽性或者假陰性。實驗室需要確定適宜的cut off值，在cut off值以上的結果可以采用自動化結果，但若出現(xiàn)比較疑似單堿基插入或缺失的未知突變，建議進行人工核對，并采用Sanger測序、ARMS-PCR、數(shù)字PCR等方法進行驗證。而對于cut off值以下的有意義位點必須進行人工核對，同時采用ARMS-PCR、數(shù)字PCR或二次建庫/測序方法進行驗證。很多實驗室的NGS測序平臺都可能會出現(xiàn)一定數(shù)量的"實驗室特異性"的突變，此類突變是該檢測系統(tǒng)特有的假陽性突變，應在報告時予以剔除。
3
信息系統(tǒng)：
信息系統(tǒng)的功能應滿足臨床需要，包括數(shù)據分析、存儲、傳輸及安全性等。生物信息分析流程應包括所有的算法、軟件、腳本、參考序列和數(shù)據庫，可以是內部的、供應商開發(fā)的或開源的。實驗室應有記錄NGS生物信息分析步驟的書面程序用來分析、解釋、報告NGS檢測結果，且針對每份NGS病例數(shù)據分析報告，需要設立追溯機制，確保檢測中涉及的生物信息數(shù)據分析流程能夠追溯。實驗室應規(guī)定原始序列核心數(shù)據的保存期限，并在醫(yī)師要求或患者檢測需要時，允許實驗室間重新分析、重新注釋及重新解釋。同時應確保NGS數(shù)據內部和/或外部存儲、轉移的保密性以及數(shù)據的完整性。
4
樣本管理：
檢測后剩余的核酸樣品應盡量長期保存，以備必要時復查，同時也為開展科研工作提供條件。有條件的實驗室可建立自己的樣本庫，樣本庫的建立需按照相關規(guī)定進行，標本的信息需完整，所有信息須由專人負責，并完善各項書面記錄。
四、總結
隨著分子生物學在血液腫瘤發(fā)病機制和臨床診療研究的不斷深入，NGS在血液腫瘤中的應用將會越來越廣泛和高效。本共識闡述了NGS在血液腫瘤中應用的基本原則和總體流程，并對血液腫瘤的臨床診療提供有效幫助。NGS在未來的技術、分析內容和結果解讀方面會不斷進步和完善，在血液腫瘤的實踐應用過程中也會帶來各種挑戰(zhàn)。
參考文獻
[1] National Comprehensive Cancer Network. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology-Acute Myeloid Leukemia （Version 2.2018）[S/OL].(2018-08-01)[2018-09-18]. https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/aml.pdf.
END
