作者 魯鳳民 王杰 陳香梅 江建寧 張文宏 趙景民 任紅 侯金林 夏寧邵
在我國(guó)，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染所致疾病仍是嚴(yán)重威脅國(guó)人健康的重大傳染性疾病。全國(guó)現(xiàn)有慢性HBV感染者約7 000萬(wàn)～9 000萬(wàn)，其中慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者約2 000萬(wàn)～3 000萬(wàn)，需立即接受治療的患者約有700萬(wàn)。然而，目前僅100萬(wàn)～350萬(wàn)慢乙肝患者正在接受抗病毒治療。雖然積極的抗病毒治療能夠明顯延緩肝臟疾病進(jìn)程、減少終末期肝病的發(fā)生，但以血清HBV表面抗原（HBsAg）轉(zhuǎn)陰作為臨床治愈的指標(biāo)，現(xiàn)行的抗病毒治療藥物僅能使很少一部分患者達(dá)到功能性臨床治愈。對(duì)于慢乙肝難以治愈的原因，既往多認(rèn)為與肝細(xì)胞核內(nèi)HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）過(guò)長(zhǎng)的半衰期有關(guān)，但近年的研究表明，cccDNA的半衰期往往不足2個(gè)月。由于現(xiàn)有的抗病毒治療藥物對(duì)cccDNA無(wú)直接破壞作用，停藥后往往發(fā)生高比例的病毒學(xué)反彈和疾病復(fù)發(fā)。因此，針對(duì)核苷（酸）類藥物[NAs）]治療的患者，各國(guó)（地區(qū)）的新指南多推薦長(zhǎng)期抗病毒治療。長(zhǎng)期甚至終生的服藥往往使患者難以接受，影響依從性。
因具有感染性的、完整的HBV病毒顆粒（丹顆粒）所攜帶的病毒基因組為帶有缺口的松弛環(huán)狀DNA（rcDNA），人們一直認(rèn)為HBV為嗜肝的DNA病毒。1996年，德國(guó)學(xué)者Köck等卻在慢性HBV感染者血清中發(fā)現(xiàn)HBV RNA的存在。我們和其他實(shí)驗(yàn)室近期對(duì)血清中HBV RNA來(lái)源的研究發(fā)現(xiàn)，患者血清中的HBV RNA實(shí)為未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA（pgRNA），這些pgRNA和rcDNA一樣，存在于成熟病毒顆粒的核衣殼內(nèi)，我們稱這種病毒顆粒為"HBV RNA病毒樣顆粒"。
1．HBV感染復(fù)制周期的新認(rèn)識(shí)：
HBV RNA病毒樣顆粒的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)HBV的感染復(fù)制過(guò)程有了更為全面的認(rèn)知。如圖1所示，來(lái)自cccDNA的3.5 kb長(zhǎng)的pgRNA與具有逆轉(zhuǎn)錄活性的病毒DNA聚合酶蛋白（p蛋白）結(jié)合形成復(fù)合物，招募核衣殼蛋白（病毒核心抗原，core）聚集形成核衣殼。在致密的核衣殼內(nèi)，多數(shù)p蛋白啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，以pgRNA為模板，先后合成出病毒的負(fù)鏈和正鏈DNA，經(jīng)多囊泡小體（MVB）釋放形成完整的子代病毒。但有一部分并未啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，致使帶有pgRNA的核衣殼也獲得病毒外膜并以病毒顆粒的形式釋放。理論上講，帶有病毒外膜的HBV RNA病毒樣顆粒同樣具有感染性，可以通過(guò)鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTCP）和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）的介導(dǎo)感染肝細(xì)胞。其核衣殼進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)環(huán)境下可以啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，形成rcDNA并可進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)化（將rcDNA的正負(fù)鏈修復(fù)完整）為cccDNA，建立感染。盡管這一推測(cè)尚缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，但考慮到丁型肝炎病毒的病毒結(jié)構(gòu)和感染模式，該推測(cè)成立的可能性很大。
| 注：a：HBV顆粒通過(guò)與肝細(xì)胞基底細(xì)胞膜側(cè)的NTCP受體結(jié)合，并在小表面抗原與HSPG結(jié)合的輔助下進(jìn)入細(xì)胞；b：宿主細(xì)胞的DNA修復(fù)系統(tǒng)將rcDNA的正鏈修復(fù)完整，形成cccDNA；c：以cccDNA為模板，轉(zhuǎn)錄出長(zhǎng)短不一的5種mRNA轉(zhuǎn)錄本；d：通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，小表面抗原形成小球形顆粒并釋放到細(xì)胞外，e抗原釋放到細(xì)胞外；e：P蛋白與前基因組RNA（pgRNA）結(jié)合，招募核心抗原形成核衣殼并將p蛋白與pgRNA包裹；f：在核衣殼內(nèi)，大部分pgRNA在p蛋白的作用下啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄，形成負(fù)鏈DNA；g：小部分核衣殼內(nèi)的pgRNA未啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄，直接獲得外包膜，以pgRNA病毒樣顆粒的形式釋放到細(xì)胞外；h：P蛋白完成跳轉(zhuǎn)，啟動(dòng)正鏈的合成；i：一部分核衣殼包裹的rcDNA可通過(guò)多囊泡小體，以Dane顆粒的形式釋放到細(xì)胞外；j：另一部分核衣殼包裹的rcDNA可以直接返回細(xì)胞核內(nèi)補(bǔ)充cccDNA池；k：完成負(fù)鏈DNA合成后，p蛋白未完全完成跳轉(zhuǎn)，在原位啟動(dòng)正鏈的合成，形成雙鏈線性DNA；l：雙鏈線性DNA易于整合到宿主細(xì)胞基因組中，可表達(dá)大、中、小表面抗原 |
圖1 乙型肝炎病毒感染復(fù)制周期示意圖
2．重新定義病毒學(xué)應(yīng)答：
對(duì)于NAs治療的慢乙肝患者，現(xiàn)有指南多將血清HBV DNA低于檢測(cè)下限定義為病毒學(xué)應(yīng)答（VR），并以此作為停藥的治療終點(diǎn)之一。然而，在重新認(rèn)識(shí)HBV的感染復(fù)制過(guò)程后，我們意識(shí)到，血清HBV DNA的消失僅僅代表了病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程被有效抑制，并不能反映cccDNA的轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)。這是因?yàn)?，在阻斷逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程后，有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA轉(zhuǎn)而以HBV RNA病毒樣顆粒的方式產(chǎn)生子代病毒，也就不難理解既往以"血清HBV DNA低于檢測(cè)值下限"為前提條件的停藥有高風(fēng)險(xiǎn)的病毒學(xué)反彈和復(fù)發(fā)了。真正的病毒學(xué)應(yīng)答應(yīng)該是既無(wú)DNA病毒、也無(wú)RNA病毒產(chǎn)生的狀態(tài)。在未來(lái)的臨床實(shí)踐中，特別是在接受NAs抗病毒治療的情況下，我們應(yīng)該以血清HBV DNA和RNA均低于檢測(cè)值下限作為病毒學(xué)應(yīng)答的判定標(biāo)準(zhǔn)。
3．慢乙肝患者血清HBsAg并不能很好反映肝組織內(nèi)cccDNA的活性：
慢乙肝患者血清中的HBsAg可以小球型顆粒、管狀顆粒存在，也可存在于丹顆粒的病毒包膜上，前兩種形式的HBsAg數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)丹顆粒。近年的研究表明，HBV通過(guò)產(chǎn)生大量的HBsAg來(lái)抑制宿主的免疫反應(yīng)，與維持病毒的持續(xù)感染有關(guān)。高水平的HBsAg也為診斷HBV感染提供了便利。血清中的HBsAg主要來(lái)自感染肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA。但越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，整合的HBV DNA片段也能轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生HBsAg。現(xiàn)已知道，在病毒復(fù)制的正鏈DNA合成過(guò)程中，當(dāng)病毒負(fù)鏈合成完畢后，如果作為正鏈合成起始引物的pgRNA殘端未發(fā)生適當(dāng)?shù)奶D(zhuǎn)而在原位啟動(dòng)正鏈的合成，就會(huì)產(chǎn)生大小約3.2 kb的雙鏈線性DNA（double-stranded linear DNA，DSL-DNA）。DSL-DNA是宿主基因組中病毒DNA整合的主要來(lái)源。Mason實(shí)驗(yàn)室最近的報(bào)道顯示，慢性HBV感染者的肝細(xì)胞存在大量的HBV DNA整合，最高可有1%肝細(xì)胞帶有整合的病毒DNA片段，也即患者最多可有上億的肝細(xì)胞帶有整合病毒片段。我們和其他實(shí)驗(yàn)室的早期研究結(jié)果顯示，整合的病毒DNA片段的斷點(diǎn)多集中在病毒基因組DR1和DR2區(qū)域，這樣病毒的S基因區(qū)域（編碼HBsAg）多保持完整，具有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HBsAg的潛能，因此，血清中的HBsAg也可能來(lái)源于整合的HBV DNA片段。
4．關(guān)于安全停藥新概念的建議：
cccDNA的清除可能最為接近病毒學(xué)治愈。然而，由于cccDNA存在于感染的肝細(xì)胞，只能通過(guò)肝活組織檢查來(lái)判斷病毒的清除和安全停藥，這在臨床實(shí)踐中并不適用。前面提到，以持續(xù)的HBV DNA未檢出（低于檢測(cè)下限）為前提的停藥有著很大的病毒學(xué)反彈和疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。故國(guó)內(nèi)外的慢性乙型肝炎防治指南均把血清HBsAg消失甚至抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性做為臨床治愈的理想治療終點(diǎn)，以降低停藥后發(fā)生病毒反彈和疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。然而，接受NAs治療慢乙肝患者HBsAg消失的比例仍然不盡如人意。延長(zhǎng)NAs治療（2～8年）后，HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性的慢乙肝患者HBsAg消失率分別僅為13%和5%），這意味著多數(shù)慢乙肝患者將面臨著終生用藥之虞。
從既往的研究報(bào)道和臨床實(shí)踐業(yè)已發(fā)現(xiàn)，有一定比例的接受NAs治療慢乙肝患者停藥后并沒(méi)有發(fā)生病毒學(xué)反彈。對(duì)于這些患者，是否有其他的安全停藥指標(biāo)可以將之甄別出呢？前面提到，核衣殼包裹的來(lái)自cccDNA的pgRNA仍可以RNA病毒樣顆粒的形式釋放，其過(guò)程不為NAs治療所阻斷。這樣，血清HBV RNA的水平就成了反映患者肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA存在和轉(zhuǎn)錄的最好指標(biāo)。當(dāng)血清中檢測(cè)不到HBV RNA時(shí)，提示患者肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的消失或者轉(zhuǎn)錄靜默，預(yù)示著可以安全停藥。通過(guò)小樣本的回顧性臨床研究，我們證實(shí)，停藥點(diǎn)血清HBV RNA未檢出的患者發(fā)生病毒學(xué)反彈的風(fēng)險(xiǎn)明顯下降。當(dāng)然，其臨床應(yīng)用尚需得到大樣本的前瞻性研究驗(yàn)證。
5．關(guān)于準(zhǔn)臨床治愈概念的建議：
由于HBV cccDNA的半衰期不足2個(gè)月。因此，新合成的rcDNA進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并轉(zhuǎn)換成cccDNA，對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA池的維持至關(guān)重要（圖1）。理論上講，通過(guò)長(zhǎng)期使用藥物可使cccDNA最終被耗竭。然而，臨床現(xiàn)實(shí)卻是，即使是接受長(zhǎng)期的NAs治療的慢乙肝患者，其HBsAg消失的比例仍然很低。對(duì)于那些HBsAg持續(xù)低水平表達(dá)的患者，部分學(xué)者一直懷疑其HBsAg是來(lái)自整合的HBV DNA片段的持續(xù)表達(dá)。最近一篇來(lái)自香港的報(bào)道研究顯示，在43例長(zhǎng)時(shí)間接受NAs治療（平均治療時(shí)間＞ 7年）的患者，有近半數(shù)肝組織內(nèi)未檢測(cè)到cccDNA，但卻只有1例發(fā)生血清HBsAg陰轉(zhuǎn)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，盡管絕大多數(shù)患者其肝組織內(nèi)HBsAg染色陽(yáng)性，卻有近半數(shù)患者肝組織內(nèi)核心抗原陰性。考慮到核心抗原的mRNA正是pgRNA，這一結(jié)果提示患者肝組織cccDNA已發(fā)生耗竭或表達(dá)靜默。該研究還發(fā)現(xiàn)，反映肝組織內(nèi)cccDNA活性的pgRNA與患者血清中的HBsAg沒(méi)有相關(guān)性?？紤]到慢乙肝患者肝臟組織高水平的HBV DNA整合，我們有理由相信，這些患者的HBsAg多來(lái)自整合的病毒DNA片段。
不同于血清HBsAg，血清中的HBV pgRNA僅能來(lái)自cccDNA。前面提到，整合的病毒DNA的主要來(lái)源DSL-DNA，全長(zhǎng)僅有3.2 kb，無(wú)法轉(zhuǎn)錄形成3.5 kb長(zhǎng)的pgRNA。的確，最近的來(lái)自我們實(shí)驗(yàn)室和一個(gè)德國(guó)實(shí)驗(yàn)室的報(bào)道均顯示，血清HBV RNA能夠很好地反映肝組織cccDNA的活性。這為通過(guò)檢測(cè)血液中的pgRNA來(lái)間接反映患者肝組織內(nèi)cccDNA的活性提供了可能。我們建議，可以以血清HBV RNA持續(xù)檢測(cè)陰性來(lái)反映患者肝組織內(nèi)cccDNA的消失或者表達(dá)靜默狀態(tài)。這些患者盡管cccDNA已被清除或處于持續(xù)的表達(dá)靜默狀態(tài)，但由于整合的病毒DNA片段可以持續(xù)低水平表達(dá)HBsAg，他們的血清HBsAg仍可有低值陽(yáng)性。我們用一個(gè)新的"準(zhǔn)臨床治愈" （para-functional cure）概念來(lái)定義這些已經(jīng)接近臨床治愈的患者，以對(duì)現(xiàn)有的慢乙肝功能性的"臨床治愈" （functional cure）概念進(jìn)行修訂和補(bǔ)充。其意義在于不僅可以讓更多的接受NAs治療的慢乙肝患者安全停藥、不再受終生用藥之苦；"治愈"率的提高也將使更多的患者愿意接受NAs為主的抗病毒治療，相信這"準(zhǔn)臨床治愈"概念必將對(duì)未來(lái)的臨床實(shí)踐產(chǎn)生一定的影響。
如前所述，血清HBV RNA檢測(cè)能夠準(zhǔn)確反映患者肝組織cccDNA活性。為了使更多特定患者發(fā)生血清HBsAg轉(zhuǎn)陰或血清學(xué)轉(zhuǎn)換、實(shí)現(xiàn)臨床治愈這一抗病毒治療的理想終點(diǎn)，建議首先對(duì)這些患者進(jìn)行血清HBsAg和HBV RNA精準(zhǔn)定量檢測(cè)。由于血清HBsAg ＜1 500 IU/ml的慢乙肝患者在接受抗病毒治療時(shí)可產(chǎn)生較好的病毒學(xué)應(yīng)答。若血清HBsAg < 200 IU/ml，病毒學(xué)應(yīng)答率更高。基于此，如果初步將血清HBsAg ＜1 500 IU/ml的NAs經(jīng)治（在治）慢乙肝患者按血清HBV RNA檢測(cè)結(jié)果分為HBV RNA陽(yáng)性患者（cccDNA轉(zhuǎn)錄及RNA病毒復(fù)制）和血清HBV RNA陰性患者（cccDNA耗竭或轉(zhuǎn)錄靜默）。對(duì)前者在繼續(xù)使用NAs治療的前提下加用peg-IFN；對(duì)后者則停用NAs，改用peg-IFN治療（圖2）。我們相信，這一基于血清HBV RNA檢測(cè)的以臨床治愈（血清HBsAg轉(zhuǎn)陰或血清學(xué)轉(zhuǎn)換）為目標(biāo)的治療路徑（方案）將進(jìn)一步提高慢乙肝臨床治愈率、降低社會(huì)成本。
圖2 以血清HBsAg和HBV RNA為指標(biāo)的慢性乙型肝炎優(yōu)化治療路徑（建議）示意圖
總之，在本文中我們完善了病毒學(xué)應(yīng)答的定義，提出了安全停藥的標(biāo)準(zhǔn)和準(zhǔn)臨床治愈的概念。未來(lái)應(yīng)開(kāi)展前瞻性多中心的研究，以驗(yàn)證以血清HBV DNA和RNA均低于檢測(cè)值下限作為病毒學(xué)應(yīng)答的判定標(biāo)準(zhǔn)和安全停藥指標(biāo)用于臨床實(shí)踐的可行性。對(duì)于血清HBsAg低值陽(yáng)性的經(jīng)治和在治患者，未來(lái)我們還應(yīng)探索以臨床治愈為目標(biāo)的、基于血清HBV RNA檢測(cè)確定治療方案的治療路徑，通過(guò)精準(zhǔn)的個(gè)體化治療提高血清HBsAg轉(zhuǎn)陰（或血清學(xué)轉(zhuǎn)換）率，讓更多人慢乙肝患者實(shí)現(xiàn)"臨床治愈" 。
摘自：中華肝臟病雜志, 2017,25(02): 105-110.
