80年代中期，俄羅斯科學(xué)院恩格爾哈得分子生物學(xué)研究所和美國阿貢國家實(shí)驗(yàn)室(ANL)的科學(xué)家們最早在文獻(xiàn)中提出了用雜交法測(cè)定核酸序列(SBH)新技術(shù)的想法。當(dāng)時(shí)用的是多聚寡核酸探針。幾乎與此同時(shí)英國牛津大學(xué)生化系的Sourthern等也取得了在載體固定寡核苷酸及雜交法測(cè)序的國際專利。
基因芯片利用微電子、微機(jī)械、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、新型材料、計(jì)算機(jī)和統(tǒng)計(jì)學(xué)等多學(xué)科的先進(jìn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在生命科學(xué)研究中樣品處理、檢測(cè)和分析過程的連續(xù)化、集成化和微型化。
1997年世界上第一張全基因組芯片——含有6166個(gè)基因的酵母全基因組芯片在斯坦福大學(xué)Brown實(shí)驗(yàn)室完成，從而使基因芯片技術(shù)在世界上迅速得到應(yīng)用。
基因芯片技術(shù)主要包括四個(gè)基本要點(diǎn)：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、核酸分子反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)。1、芯片制備，先將玻璃片或硅片進(jìn)行表面處理，然后使核酸片段按順序排列在芯片上。2、樣品制備，可將樣品進(jìn)行生物處理，獲取其中的DNA、RNA，并且加以標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度。3、生物分子反應(yīng)，芯片上的生物分子之間的反應(yīng)是芯片檢測(cè)的關(guān)鍵一步。通過選擇合適的反應(yīng)條件使樣品中的核酸分子與芯片上的核酸分子反應(yīng)處于最佳狀況中，減少錯(cuò)配比率。4、芯片信號(hào)檢測(cè)，常用的芯片信號(hào)檢測(cè)方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過掃描以獲得有關(guān)生物信息。
基因芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)是將從樣品制備、雜交反應(yīng)到信號(hào)檢測(cè)的整個(gè)分析過程集成化以獲得微型全分析系統(tǒng)(micro total analytical system)或稱縮微芯片實(shí)驗(yàn)室(laboratory on a chip)。使用縮微芯片實(shí)驗(yàn)室，就可以在一個(gè)封閉的系統(tǒng)內(nèi)以很短的時(shí)間完成從原始樣品到獲取所需分析結(jié)果的全套操作。
近年,基因芯片技術(shù)在疾病易感基因發(fā)現(xiàn)、疾病分子水平診斷、基因功能確認(rèn)、多靶位同步超高通量藥物篩選以及病原體檢測(cè)等醫(yī)學(xué)與生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
一、第一代基因芯片
第一代基因芯片基片可用材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜和尼龍膜,其中以玻片最為常用。為保證探針穩(wěn)定固定于載體表面,需要對(duì)載體表面進(jìn)行多聚賴氨酸修飾、醛基修飾、氨基修飾、巰基修飾、瓊脂糖包被或丙烯酰胺硅烷化,使載體形成具有生物特異性的親和表面。最后將制備好的探針固定到活化基片上,目前有兩種方法:原位合成和合成后微點(diǎn)樣。根據(jù)芯片所使用的標(biāo)記物不同,相應(yīng)信號(hào)檢測(cè)方法有放射性核素法、生物素法和熒光染料法,在以玻片為載體的芯片上目前普遍采用熒光法。
相應(yīng)熒光檢測(cè)裝置有激光共聚焦顯微鏡、電荷偶合器( charge coup led devices, CCD)、激光掃描熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描儀等。其中的激光共聚焦掃描儀已發(fā)展為基因芯片的配套檢測(cè)系統(tǒng)。經(jīng)過芯片掃描提取雜交信號(hào)之后,在數(shù)據(jù)分析之前,首先要扣除背景信號(hào),進(jìn)行數(shù)據(jù)檢查、標(biāo)化和校正,消除不同實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的誤差。
對(duì)于簡單的檢測(cè)或科學(xué)實(shí)驗(yàn),因所需分析基因數(shù)量少,故直接觀察即可得出結(jié)論。若涉及大量基因尤其是進(jìn)行表達(dá)譜分析時(shí),就需要借助專門的分析軟件,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)知識(shí)進(jìn)行深入、系統(tǒng)的分析,如主成分分析、分層聚類分析、判別分析和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析等。
芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)束并不表示芯片實(shí)驗(yàn)的完成,由于基因芯片獲取的信息量大,要對(duì)呈數(shù)量級(jí)增長的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效管理,需要建立起通行的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存和交流平臺(tái),將各實(shí)驗(yàn)室獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果集中起來形成共享的基因芯片數(shù)據(jù)庫,以便于數(shù)據(jù)的交流及結(jié)果的評(píng)估。
典型如SuperArray公司的功能分類基因芯片：
1、引物設(shè)計(jì)
SYBR Green可與所有的雙鏈DNA反應(yīng)(包括引物二聚體)，為了使擴(kuò)增反應(yīng)集中于目的基因，避免非特異性擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)成為關(guān)鍵因素。為得到單一特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，避免擴(kuò)增出序列相似的非特異性產(chǎn)物，采用BLAST或者其他比對(duì)方法，檢測(cè)引物在相應(yīng)物種(如人，小鼠或大鼠)全基因組中的特異性。為了保證在相同的PCR條件下(特別是統(tǒng)一的退火溫度)，不同基因均能擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性產(chǎn)物，對(duì)引物的CG值，解鏈溫度(Tm)，以及其他化學(xué)和物理的特性都進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整。為了獲得高擴(kuò)增效率，對(duì)擴(kuò)增片段的長度也進(jìn)行了優(yōu)化，一般為100到200bp，確保在統(tǒng)一的循環(huán)反應(yīng)的時(shí)間范圍內(nèi)，不同基因均能擴(kuò)增出完整片段。
2、反應(yīng)體系
為避免非特異性擴(kuò)增，使用化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)Taq酶，只有經(jīng)過熱激步驟，Taq酶才能發(fā)揮擴(kuò)增活性。同時(shí)，反應(yīng)體系經(jīng)過優(yōu)化，可最大限度減少引物二聚體形成，并且保證較難擴(kuò)增的片段都得到極高的擴(kuò)增效率。
3、定量結(jié)果可靠
在標(biāo)準(zhǔn)的96孔PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，為了獲得高通量，無法為每個(gè)樣品單獨(dú)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。在完全相同的PCR反應(yīng)條件下，希望表達(dá)量不同的多個(gè)基因均獲得可靠的結(jié)果，需要確保每個(gè)基因都有較高的擴(kuò)增效率，從而可采用簡單的△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)量。
其靈敏度高，樣品的使用量低，每張芯片使用的總RNA最少可為0.5ng;可觀察到的動(dòng)態(tài)線性范圍超過105，可以同時(shí)檢測(cè)表達(dá)量差異較大的基因;Ct值的平均差異只有0.25個(gè)循環(huán)，可檢測(cè)超過兩倍的基因表達(dá)量變化。因此，第二代功能分類基因芯片是研究特定信號(hào)通路或者一組功能相關(guān)基因表達(dá)量的理想方法。
二、第二代基因芯片
盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，但仍然存在著許多難題和不足。目標(biāo)分子的標(biāo)記是重要的限速步驟，如何繞過這一步是人們一直期望解決的問題。其次是檢測(cè)靈敏度不高，重復(fù)性差，無法檢測(cè)單堿基錯(cuò)配的基因樣品。再者，待檢測(cè)的基因樣品必須經(jīng)過PCR擴(kuò)增技術(shù)的處理以獲得足夠量的待檢測(cè)樣品，使檢測(cè)過程相對(duì)復(fù)雜。我們稱具備以上特征的基因芯片技術(shù)為第一代基因芯片技術(shù)，這些特征充分說明基因芯片技術(shù)本身存在著較大的發(fā)展空間。
第二代基因芯片包括如下幾種：
1. 電極陣列型基因芯片：將微電極在襯底上排成陣列，通過對(duì)氧化還原指示劑的電流信號(hào)的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)基因序列的識(shí)別;
2. 非標(biāo)記熒光指示基因芯片：利用熒光分子作為雜交指示劑，在不需對(duì)靶基因進(jìn)行熒光標(biāo)記的前提下，通過對(duì)熒光分子的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)基因序列的識(shí)別;
3. 量子點(diǎn)指示基因芯片：利用量子點(diǎn)作為雜交指示劑，在不需對(duì)靶基因進(jìn)行熒光標(biāo)記的前提下，通過對(duì)量子點(diǎn)的掃描實(shí)現(xiàn)基因序列的識(shí)別;
4. 分子燈塔型基因芯片：利用探針DNA片斷的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，獲得單堿基突變檢測(cè)的能力。
三、第三代基因芯片
目前，眾多的第三代基因芯片現(xiàn)在也推向了市場。第三代基因芯片代表了測(cè)序的最高水平和未來走向。
1、Illumina微珠基因芯片技術(shù)
這是Illumina公司核心技術(shù)之一，博奧生物基于Illumina微珠芯片平臺(tái)，推出SNP分型檢測(cè)服務(wù)以及定制SNP分型檢測(cè)服務(wù)。
它首先用微機(jī)電技術(shù)在光纖末端或硅片基質(zhì)上蝕刻出微孔(深度約為3毫米的相同凹槽)，將“微珠池“內(nèi)的微珠“倒”入光纖束微孔，每個(gè)微孔恰可容納一個(gè)微珠，在范德華力和與微孔壁間流體靜力學(xué)相互作用下，微珠以“無序自組裝”的方式在微孔內(nèi)組裝成芯片。每種類型的微珠平均有 30 倍左右的重復(fù)。
每一個(gè)微珠上都偶聯(lián)有80萬左右拷貝數(shù)的探針。每一個(gè)探針由特異的地址序列(對(duì)每種微珠進(jìn)行解碼，29mer)和特異序列(代表不同的檢測(cè)信息，如SNP 位點(diǎn)序列、基因序列等)組成。用專利的解碼技術(shù)對(duì)芯片上的微珠進(jìn)行解碼，完成對(duì)芯片微珠定位信息的收集和確認(rèn)，也實(shí)現(xiàn)芯片生產(chǎn)過程中100%質(zhì)控。
以四種熒光標(biāo)記進(jìn)行16種微珠解碼為例，解碼過程使用與地址序列互補(bǔ)的且分別標(biāo)記4種熒光染料的探針進(jìn)行。把標(biāo)記4種熒光的不同地址序列探針進(jìn)行組合，每次雜交后探針清洗下來進(jìn)行下一輪雜交，通過多輪雜交達(dá)到指數(shù)型區(qū)分能力。
2、Ion Torrent半導(dǎo)體基因芯片
Ion Torrent半導(dǎo)體基因芯片是最新一代的測(cè)序技術(shù)，它的問世給測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用帶來了激動(dòng)人心的進(jìn)展。它采用了半導(dǎo)體技術(shù)和簡單的化學(xué)試劑進(jìn)行DNA測(cè)序，而不是使用光作為媒介。在半導(dǎo)體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ATCG。隨著每個(gè)堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過每個(gè)孔底部時(shí)能被檢測(cè)到，通過對(duì)H+的檢測(cè)，實(shí)時(shí)判讀堿基。
Ion Torrent個(gè)人化操作基因組測(cè)序儀(PGMTM)是第一臺(tái)基于半導(dǎo)體技術(shù)的測(cè)序儀。與其他測(cè)序技術(shù)相比，使用該項(xiàng)技術(shù)的測(cè)序系統(tǒng)更簡單、更快速、及更易升級(jí)。該測(cè)序儀與其他高通量測(cè)序儀特征互補(bǔ)，可以迅速完成應(yīng)急服務(wù)項(xiàng)目，縮短服務(wù)周期，增加服務(wù)效率。
3、實(shí)時(shí)單分子測(cè)序基因芯片
太平洋生物科學(xué)公司(PacBio)實(shí)時(shí)單分子測(cè)序基因芯片是直接測(cè)由DNA聚合酶將熒光標(biāo)記的核苷酸摻入互補(bǔ)測(cè)序模板。該技術(shù)的核心是一個(gè)零點(diǎn)啟動(dòng)模式的波導(dǎo)(Zero-mode Wavelength，ZMW)納米結(jié)構(gòu)的密集排列， 這一排列陣可以進(jìn)行單個(gè)熒光分子的光學(xué)審視。
在過去，零點(diǎn)啟動(dòng)模式波導(dǎo)結(jié)構(gòu)被用于從大量高密度的分子中分辨出單一的熒光分子，還沒有被用于大量平行分析的操作。為使之用于大量平行分析和數(shù)據(jù)輸出通量(測(cè)序數(shù)據(jù)生成能力)，太平洋生物科學(xué)公司開發(fā)出一種方法，能有效地將零點(diǎn)啟動(dòng)模式波導(dǎo)結(jié)構(gòu)排到表面上，他們采用了電子束光刻技術(shù)(Electron beam Lithography)和紫外光電子束光刻技術(shù)(Ultraviolet Photo lithography) 以及高度平行的共焦成像系統(tǒng)， 這樣可以對(duì)零點(diǎn)啟動(dòng)模式納米結(jié)構(gòu)中的熒光標(biāo)記分子進(jìn)行高靈敏度和高分辨率的探測(cè)，并采用了一個(gè)沉重的穩(wěn)定平臺(tái)來確保良好的光學(xué)聚焦效果。
4、納米球基因芯片
全基因組學(xué)公司(Complete Genomics)的納米球基因芯片是以雜交和連接反應(yīng)為核心的。當(dāng)通過雜交和連接進(jìn)行測(cè)序的方法出現(xiàn)以后，全基因組學(xué)公司推出了新的樣品處理方法和納米陣列平臺(tái)?；蚪MDNA首先經(jīng)過超聲處理，再加上一些接頭，然后模板環(huán)化，酶切。最后產(chǎn)生大約400個(gè)堿基的環(huán)化的測(cè)序片段，每個(gè)片段內(nèi)含有4個(gè)明確的接頭位點(diǎn)。環(huán)化片段用Φ29聚合酶擴(kuò)增2個(gè)數(shù)量級(jí)。一個(gè)環(huán)化片段所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物稱為DNA納米球(DAN nanoball, DNB)。納米球被選擇性地連接到六甲基二硅氮烷處理的硅芯片上。
5、納米孔基因芯片技術(shù)
另外，還在發(fā)展中的納米孔基因芯片技術(shù)是很有潛力的第四代技術(shù)。因?yàn)檫@種方法不再需要光學(xué)檢測(cè)和同步的試劑洗脫過程了。
這是一種基于納米孔(納米洞)結(jié)構(gòu)的完全不同的測(cè)序技術(shù)，單個(gè)堿基的讀取可以靠測(cè)定經(jīng)由納米級(jí)別的孔洞而跨越或透過薄膜的電導(dǎo)率來進(jìn)行。納米孔技術(shù)可以廣泛地歸納為兩類：生物類和固態(tài)類。
α溶血素是一種能天然性地連接到細(xì)胞膜中繼而導(dǎo)致細(xì)胞溶解的蛋白質(zhì)，它第一個(gè)被用來做成生物納米孔模型。第二類納米孔是以硅及其衍生物進(jìn)行機(jī)械制造而成。 使用這些合成的納米孔可以降低在膜穩(wěn)定性和蛋白定位等方面的麻煩，而這些正是牛津納米孔公司所創(chuàng)立的生物納米孔系統(tǒng)一直遇到的問題。
例如，Nabsys就發(fā)明了一套系統(tǒng)，他們以匯聚的離子束將硅片薄膜打成納米孔，用于檢測(cè)與特異性引物進(jìn)行了雜交的單鏈DNA穿過納米孔時(shí)的阻斷電流變化。 IBM創(chuàng)建了一個(gè)更為復(fù)雜的系統(tǒng)，能有效地使DNA位移暫停，并在暫停的時(shí)候通過隧道電流檢測(cè)識(shí)別每個(gè)堿基。
四、基因芯片市場分析
1、國外市場美國illumina公司一家獨(dú)大
在SNP芯片研究領(lǐng)域，美國illumina公司毫無疑問是霸主，illumina公司憑借自己開發(fā)的GoldenGate技術(shù)和infinium專利技術(shù)一直在SNP芯片領(lǐng)域處于壟斷地位。
illumina的全基因組表達(dá)譜芯片是目前唯一一種可以達(dá)到探針30倍重復(fù)的表達(dá)譜芯片，其他的芯片都只能達(dá)到1-8倍技術(shù)重復(fù)。因此illumina的全基因組表達(dá)譜芯片的重復(fù)性是所有芯片中最高的，其重復(fù)性R2>0.996，并且基于第三代基因芯片獨(dú)特的微珠芯片生產(chǎn)工藝，芯片生產(chǎn)成本較低，信噪比和靈敏度都非常高，其靈敏度≤1:250,000，芯片檢測(cè)結(jié)果和qPCR相關(guān)系數(shù)R2=0.97。
因?yàn)閕llumina所占的市場份額越來越多，2012年6月另一基因芯片大廠家Nimblegen公司，正式宣布退出基因芯片市場。
2、國內(nèi)市場剛剛起步
國內(nèi)基因芯片制造水平低，相關(guān)的企業(yè)規(guī)模小、投入也少，遠(yuǎn)達(dá)不到國外的水平。所以國內(nèi)的相關(guān)公司均以引進(jìn)國外基因芯片，提供檢測(cè)服務(wù)為主。不過，隨著基因芯片的應(yīng)用推廣，一些公司也開始涉足基因芯片制造。
上市公司達(dá)安基因，業(yè)務(wù)以體外診斷為主，產(chǎn)品主要是試劑盒，但也開始涉足基因芯片制造。達(dá)安基因2013年申報(bào)的三個(gè)專利：一種用于基因檢測(cè)的電路板 ZL201320244125.X;一種電化學(xué)基因芯片 ZL201320244116.0;一種基于基因芯片的檢測(cè)裝置 ZL201320244734.5。
而另一以基因檢測(cè)服務(wù)著稱的大企業(yè)華大基因，則通過收購國外公司進(jìn)入基因芯片制造領(lǐng)域。美國上市公司Complete Genomics 公司有自己基因芯片和芯片檢測(cè)設(shè)備。但該公司2011年的業(yè)績只有2000多萬美元，其基因測(cè)序服務(wù)成長大大低于預(yù)期，股票跌破發(fā)行價(jià)，最后被中國華大基因收購。
聯(lián)川生物在microRNA芯片領(lǐng)域也小有名氣，也是唯一一家國產(chǎn)的microRNA芯片，該芯片最大的特點(diǎn)就是更新速度極快，一般新的數(shù)據(jù)庫發(fā)表后，第一個(gè)將芯片更新到最新版本的就是聯(lián)川生物。illumina公司于2010年退出了microRNA芯片市場，因illumina公司2006年收購了高通量測(cè)序領(lǐng)域NO.1的Solexa公司，成為唯一一家即擁有芯片平臺(tái)又擁有高通量測(cè)序平臺(tái)的供應(yīng)商，illumina認(rèn)為在microRNA領(lǐng)域，高通量測(cè)序有不可比擬的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，必然會(huì)取代芯片，所以于2010年停產(chǎn)了microRNA芯片。
注：最新的測(cè)序技術(shù)會(huì)實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化、實(shí)時(shí)化、微型化，雖然與傳統(tǒng)的芯片技術(shù)并不相同，但其理念有共通之處，所以也將其納入“芯片”范疇。——彭雷
