腫瘤病人外周血循環(huán)稀有細(xì)胞 (circulating rare cells, CRCs) 主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs) 和循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞 (circulating endothelial cells, CECs)。CECs不僅與血管生成和腫瘤生長(zhǎng)、播散有關(guān)，還能夠作為抗血管生成藥物的靶點(diǎn)和療效評(píng)估的標(biāo)志物。
CTC的染色體異倍體特征及其臨床意義以往已有很多論述，而對(duì)于CEC的染色體倍體研究目前還沒(méi)有任何相關(guān)報(bào)道。最近，由國(guó)際著名的德國(guó) Ludwig-Maximilians 大學(xué)醫(yī)學(xué)中心 (LMU) 、上海第一人民醫(yī)院腫瘤中心及賽特生物 (Cytelligen/Cytointelligen) 密切合作，應(yīng)用SE-i•FISH®整合技術(shù)，在共同完成的多瘤種、多中心的聯(lián)合臨床實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)，腫瘤病人體內(nèi)不僅存在染色體異倍體CTCs (CD31-/CD45- ) ，同時(shí)也存在著顯著數(shù)量的染色體異倍體CECs (循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，CD31+/CD45- )，以及“腫瘤上皮-內(nèi)皮融合型細(xì)胞和癌栓”(tumor epi-endo fusion cells and clusters)。該研究不僅可以幫助人們進(jìn)一步深入了解CEC在腫瘤血管生成與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的相關(guān)性，更重要的是，使人們首次能夠有效區(qū)分、鑒別腫瘤病人血液中的異倍體CTCs及異倍體CECs這兩類完全不同的細(xì)胞。在極大地提高了CTC檢測(cè)的特異性同時(shí)，亦可同步對(duì)CEC的臨床意義，以及CEC與CTC如何相互協(xié)同等方面開(kāi)展深入研究。該研究成果經(jīng)Nature Biotechnology (自然•生物技術(shù)) 編輯部特別推薦，已發(fā)表在Scientific Reports雜志上 (Lin et al., 2017 Sci Rep 7:9789)。
染色體異倍體CEC
染色體異倍體是惡性細(xì)胞的最典型特征 (Kops et al., 2005 Nat Rev Cancer 5:773; Gordon, et al., 2012 Nat Rev Genet 13:189)。正常組織中的內(nèi)皮細(xì)胞為二倍體，一般統(tǒng)稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤組織中的異倍體內(nèi)皮細(xì)胞，定義為腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞 (tumor endothelial cells, CD31+/CD45- ) (Hida et al., 2004 Cancer Res 64:8249)。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞CEC 在腫瘤血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有極其重要的臨床意義 (Bertolini et al., 2006 Nat Rev Cancer 6:835)，然而以往對(duì)于外周血CEC染色體倍體的鑒別及相關(guān)臨床意義的研究則一直處于空白。本實(shí)驗(yàn)研究人員借助賽特SE-i•FISH® 及Metafer-i•FISH® 全自動(dòng)六通道CRC掃描與圖像分析系統(tǒng)的特殊技術(shù)優(yōu)勢(shì)，對(duì)腫瘤病人體內(nèi)的CTC與CEC進(jìn)行了系統(tǒng)性的檢測(cè)、鑒別與比較，首次發(fā)現(xiàn)了染色體異倍體循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞CEC的存在。文中大量研究證實(shí)，除少部分表達(dá)CD31+/CD34+ (循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞，CEP) 或CD31+/CD146+ (成熟CEC) 外，大部分該類細(xì)胞具有未曾報(bào)道過(guò)的特殊蛋白表型CD31+/CD34-/CD133-/CD105-/CD146-/CD45-。
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，除異倍體CECs外，某些腫瘤病人體內(nèi)還存在著異倍體epi-endo融合型腫瘤細(xì)胞及癌栓，且該類融合型細(xì)胞或癌栓具有迄今為止沒(méi)有報(bào)道過(guò)的獨(dú)特蛋白表型 (CD31+/EpCAM+/Vimentin+/CD45- )。
異倍體CEC存在于腫瘤病人與正常人體內(nèi)
進(jìn)一步的臨床對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異倍體CECs 不僅存在于所有腫瘤病人體內(nèi)，66% 受檢的正常人群 (n=47) 中也發(fā)現(xiàn)了該類細(xì)胞。但病人與正常人相比（6 ml 血液），無(wú)論異倍體CECs的陽(yáng)性率 (腫瘤病人vs正常人: 100% vs 66%)，還是人均異倍體CEC 細(xì)胞數(shù)目 (腫瘤病人vs正常人: 8.8±14.3 vs 2.8±3.6, mean ± SD)，均呈現(xiàn)顯著性差異。
異倍體CEC在腫瘤病人與正常人群中的表型差異、功能的異同、以及循環(huán)腫瘤CEC在腫瘤生成、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中的臨床意義仍有待進(jìn)一步深入研究。
異倍體循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞CEC (CD31+ ) 與異倍體循環(huán)腫瘤上皮細(xì)胞CTCs (CD31- ) 是兩類完全不同的細(xì)胞，且具有不同的臨床與生物學(xué)意義。隨著本文的發(fā)表，人們對(duì)這兩類細(xì)胞的認(rèn)知日漸清晰，兩者絕不能再混為一談！顯而易見(jiàn)，對(duì)異倍體CECs與CTCs的有效區(qū)分與鑒別，已成為高特異性地準(zhǔn)確檢測(cè)CTC的必要前提！
多重瘤標(biāo)-iFISH
本文不僅向人們展示了獨(dú)特的SE-i•FISH®技術(shù)用于同步檢測(cè)CECs 與 CTCs ，而且也為廣大腫瘤界同行提供了研究CTC上多重腫瘤細(xì)胞標(biāo)示物的有效技術(shù)平臺(tái)。借助賽特生物與蔡司、MetaSystems聯(lián)合開(kāi)發(fā)的Metafer-i•FISH® 全自動(dòng)CTC圖像掃描與分析系統(tǒng)，5通道雙瘤標(biāo)-iFISH及6通道三瘤標(biāo)-iFISH將有助于人們研究、檢測(cè)CRCs上不同腫瘤標(biāo)示物是如何與染色體倍體相互協(xié)同 ，從而在腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
SE細(xì)胞活性：
賽特生物CTC差相富集 (Subtraction Enrichment, SE) 與其它陰性富集方法的最大區(qū)別之一在于，SE富集避免使用低滲裂解法，而是使用本研究作者發(fā)明的特殊離心介質(zhì)去除紅細(xì)胞 (Lin et al., 1999 J Cell Biol 145:279; Lin et al., 2009 Mol Neurodegener 4:1)，從而避免了低滲對(duì)CRC造成的損傷。本研究對(duì)經(jīng)過(guò)SE富集及優(yōu)化的液態(tài)免疫熒光染色 (Lin et al., 2000 PNAS 97:674) 后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞活性評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)SE富集及免疫染色，無(wú)論是腫瘤細(xì)胞還是殘留的白細(xì)胞，均保持了極高的細(xì)胞活性，存活率分別為95.3±2% (腫瘤細(xì)胞) 及 93±2.1% (白細(xì)胞) (mean ± SD)。差相富集過(guò)程及本文采用的免疫熒光染色方法對(duì)細(xì)胞活性的影響微乎其微。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SE富集CTC后，采用Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，7-AAD 標(biāo)記壞死細(xì)胞 (necrotic cell)，同時(shí)結(jié)合液態(tài)免疫熒光染色，可以為人們提供額外的技術(shù)手段，用于觀測(cè)腫瘤治療方法對(duì)體內(nèi)CTC或體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，從而達(dá)到篩選腫瘤用藥及評(píng)估療效的目的。
SE CTC原代細(xì)胞培養(yǎng)、CDX腫瘤模型、腫瘤活細(xì)胞生物樣本庫(kù)
為了便于人們對(duì)賽特生物SE-iFISH的技術(shù)路線及各種應(yīng)用有一個(gè)比較清晰的了解，本文將相關(guān)信息匯總成流程圖如下：
需要特別指出的是，SE富集分離出具有極高生物活性的各種體液來(lái)源 (如血液、胸水、腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺等) 的腫瘤細(xì)胞可適于原代細(xì)胞培養(yǎng)。本文作者與美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校腫瘤中心 (UCSD Moores Cancer Ctr) 的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)證明，原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞純度在培養(yǎng)過(guò)程中明顯不斷提高，且可反復(fù)凍融。這些培養(yǎng)的CTC原代細(xì)胞，或克隆化培養(yǎng)的具有不同臨床意義的CTC亞類細(xì)胞，可用于后續(xù)CDX腫瘤動(dòng)物模型的建立 (Hodgkinson et al., 2014 Nat Med 20:897; Alix-Panabieres et al., 2016 Mol Oncol 10:443) 及腫瘤活細(xì)胞標(biāo)本庫(kù)的建立。相對(duì)于石蠟包埋的病理組織切片，或單純的血漿蛋白、血漿核酸片段，SE富集得到的各種腫瘤細(xì)胞 (包括CTC) 不但具有生物活性，而且包含了完整的腫瘤細(xì)胞核酸與蛋白信息，從而為進(jìn)一步開(kāi)展腫瘤研究及建立具有真正意義與應(yīng)用價(jià)值的“腫瘤活細(xì)胞生物樣本庫(kù)”(Biobank for Viable Tumor Cells) 奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
i•FISH CTC單細(xì)胞測(cè)序
類似于腫瘤的高異質(zhì)性，不同CTC之間也存在著極大的差異。借助SE-i•FISH®技術(shù)，根據(jù)染色體異倍體數(shù)目及腫瘤標(biāo)示物的蛋白表達(dá)，對(duì)CTC進(jìn)行亞類分型 (Lin, 2015 Clin Transl Med 4:38)，發(fā)現(xiàn)各個(gè)亞類的CTC具有不同的臨床意義，如腫瘤耐藥 (Li et al., 2014 Oncotarget 5:6594)、病人預(yù)后 (Li et al., 2015 Chin J Cancer Res 28:579) 等。對(duì)于今后開(kāi)展CTC單細(xì)胞分析工作，顯然不再是隨意挑取檢測(cè)出的CTC，而是應(yīng)針對(duì)性地挑取與不同臨床意義 (如腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等) 密切相關(guān)的CTC亞類單細(xì)胞。
多瘤種、多中心、多瘤標(biāo)CTC臨床實(shí)驗(yàn)及展望
目前國(guó)際上至少有22個(gè)多瘤種、多中心的CTC臨床實(shí)驗(yàn)正在積極進(jìn)行中 (Wang et al., 2017 Oncotarget 8:1884)。除CTC計(jì)數(shù)外，這些臨床研究更加關(guān)注與CTC相關(guān)的20個(gè)腫瘤標(biāo)示物及與DTC相關(guān)的14個(gè)瘤標(biāo) (EpCAM, Vimentin, HER2 等) 蛋白表達(dá)的臨床意義。
隨著賽特生物SE-i•FISH®技術(shù)的不斷普及應(yīng)用，人們不僅可以在CTC上聯(lián)合檢測(cè)具有特定臨床意義的染色體異倍體及各種瘤標(biāo)蛋白表達(dá)，同時(shí)還可以對(duì)循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞CEC的臨床意義進(jìn)行深入研究。循環(huán)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞CEC (Carmeliet & Jain, 2000 Nature 407:249)、腫瘤CEC細(xì)胞栓 (Cima et al., 2016 Sci Transl Med 8:345)、CTC癌栓 (Cheung et al., 2016 Science 352:167) 及Vimentin (Tsai & Yang et al., 2013 Genes Dev 27:2192) 在腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、耐藥、預(yù)后、復(fù)發(fā)等過(guò)程中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用。因此，在同一標(biāo)本上同時(shí)完成對(duì)CTC與CEC的有效鑒別及檢測(cè)，不僅極大地提高了CTC檢測(cè)的特異性，同時(shí)可以幫助人們進(jìn)一步探索CTC與CEC在腫瘤生成、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中如何不斷相互協(xié)同，并發(fā)揮重要作用。
