| 導讀 |
全基因組或外顯子組測序的臨床應用，稱為臨床基因組和外顯子測序，由于該技術檢測范圍廣，可以同時檢測2000多個基因的變異，對于臨床罕見病、疑難疾病、復雜疾病，特別是孟德爾遺傳病的診斷是一種強大而有效的方法
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全基因組或外顯子組測序的臨床應用，稱為臨床基因組和外顯子測序( Clinical genome and exome sequencing，CGES）。由于該技術檢測范圍廣，可以同時檢測2000多個基因的變異，對于臨床罕見病、疑難疾病、復雜疾病，特別是孟德爾遺傳病的診斷是一種強大而有效的方法。
全基因組測序（Genome sequencing）是針對個體的所有基因序列進行測序分析，測序范圍廣，數據多，分析困難，專業(yè)性強，費用昂貴，目前還難以大規(guī)模應用于臨床。而外顯子組的序列只占全基因組序列的1%，大多數與疾病相關基因變異位于外顯子區(qū)域，因此，與全基因組測序相比，外顯子組測序（Exome sequencing）以其經濟有效的優(yōu)勢廣泛用于鑒定遺傳性疾病的基因變異。但是，由于運用該技術鑒別成因性變異的成功率僅約為25% ，這就使得臨床醫(yī)生了解該技術的基礎原理以及如何選擇最有可能從中受益的患者顯得非常重要，同時還應該熟悉外顯子組測序的診斷適應癥才能更加有效地運用于臨床實踐。
1、 CGES的局限性
CGES是檢測單核苷酸替代、插入以及8-10個甚至更少的核苷酸缺失突變的最有效的方法，而對于拷貝數變異、染色體的非整倍體、長插入缺失變異、DNA重復序列等形式的基因變異則沒有那么精確。同時，不管是全基因組測序還是外顯子組測序都存在測序覆蓋率的問題，一般情況下，測序所得出的數據僅能覆蓋目標序列的85~95%。因此，即便運用全基因組測序，仍然存在致病性變異漏檢的可能。
2 、CGES的應用
CGES是疑似罕見的孟德爾疾病的最佳診斷方法。當患者已經排除常見的單基因缺陷，同時又考慮到多基因缺陷的檢測方法太昂貴時，CGES就是最好的選擇。由于很多遺傳性疾病都是在童年出現臨床表現，因此實施CGES檢測的患者是以兒童為主，它不僅可能幫助患者及其家屬找到病因和疾病治療相關方法，同時還可以了解疾病的再發(fā)風險。
若考慮患者需要做CGES檢測，測試前的咨詢至關重要。首先，最主要是要確定患者的真實期望，以及提醒患者或者家族成員：陽性的結果并不意味著一定可以改變治療方案和改善預后[9]。其次，還必須告訴患者，與欲檢測疾病不相關的基因突變也可能發(fā)現并出具于報告中。在大多數情況下，外顯子組測序較單個基因測序更加高效。
除此之外，醫(yī)生還需要準備四個要素：收集家系的信息、系統(tǒng)評估患者的表型、查找醫(yī)學文獻和數據庫和簽署知情同意書。一份完整的家系可以用于評估家系其他成員中有沒有相似或者相關的表型，以確定疾病遺傳模式。同時，先證者和家系中的其他患者也必須排除其他的潛在相關的臨床表現。當有了一個完整的家系資料、全面的表型特征、相關疾病的文獻綜述以及數據庫，便可以基本明確患者是否是患有罕見的遺傳病。
那么如何選擇家系中的成員進行測序分析呢？這個和遺傳模式（顯性或者隱性）以及家系中的其他成員是否具有相類似的臨床表現有關。當懷疑某個變異是新發(fā)異時，患者的雙親通常也要進行相關檢測，若患者的雙親證實沒有攜帶相關變異，而他們的親緣關系是確定的情況下，患者所攜帶的變異即認定為新發(fā)[10]。但是，當主要的遺傳條件受到質疑的情況下，患者的父母，兄弟姐妹、甚至遠房親戚都應該檢測，這主要取決于家系的特殊性以及家系成員之間的親緣關系。而在另外一些情況下，如果只針對患兒行CGES檢測，隨后對患病和非患病的親屬進行基因型分型，如果可以表現出變異和疾病的共分離現象，也可以說明變異的致病性。
CGES可以發(fā)現已知的致病性變異和以前沒有報導過但對人類有明確致病性的基因變異。另外，部分實驗室也報告一些新的基因突變，但是并不確定它是否可以引起人類疾病。因此，開展一些基因突變的致病機制研究顯得十分必要。
3 、CGES的結果評估
在部分CGES報告中，可以直接明確疾病的成因性變異；然而，有些報告中基因變異的意義需要由醫(yī)生和遺傳咨詢師共同來鑒別。實際上，在大多情況下，報告并沒能鑒別出看似合理的突變。
評估CGES結果最主要是要考慮到測序和臨床的正確性。分析的正確性是衡量患者是否真的攜帶CGES檢測結果中的特殊基因型，是由實驗的準確度決定的。而臨床的正確性則更復雜，更難評估，這取決于一種特殊的疾病是否是真正由特殊的基因突變所致以及這種突變是否有明確的致病性。
CGES的陽性發(fā)現往往是非常準確的，但是假陰性率則根據基因組的區(qū)域不同而不同。正是這個原因，CGES才一直沒能真正替代可疑目的基因測序或者特定條件下優(yōu)化了的基因panels的測序[11]。大部分實驗室驗證CGES的陽性結果都是運用PCR擴增和Sanger測序。如果測序公司沒有對CGES的實驗結果提供實驗驗證，若要基于CGES結果實施醫(yī)學干預，那么實施之前都應該運用Sanger測序進行驗證。
分析CGES數據的一般方法是將基因變異數據和已知的變異數據庫比對，進而根據描述了變異和表型關系的文獻報道分析。然而，在臨床醫(yī)生綜合分析測序結果時，應該充分了解和疾病發(fā)生無關的變異，同時認識到由于CGES測序是同時測出成千上萬基因的序列，所以測序結果出現錯誤歸因的概率是較高的。
明確疾病特異性基因變異主要的臨床意義是對過去難以診斷的復雜疾病或遺傳疾病進行診斷。有時，病因明確后可以給出特殊的治療策略并對臨床預后產生預想不到的改變。而在大部分情況下，致病基因的發(fā)現并不能改變臨床的治療策略以及預后，但是，它不僅可以為患者減少后續(xù)的一些昂貴的或者侵入性的檢測手段，還可以提供疾病再發(fā)風險評估以及為患者及其親屬提供孕前干預或者胎兒的產前診斷。對于一些成年后發(fā)病的疾病來說，患者可以在在臨床癥狀出現前對致病性基因突變進行檢測，還對有發(fā)病風險的兄弟姐妹進行致病基因篩查和預防性治療來改善臨床預后。
4 、CGES結果解釋和溝通
臨床醫(yī)生需要綜合考慮由實驗室遺傳學者提供的CGES結果，并將結果放在相關的醫(yī)學環(huán)境中分析。一個明確的基因變異可能的結局有以下幾種：1、提示患者過去的疾病既往史；2、提示患者還需要做一些額外的醫(yī)學檢查；3、揭示出過去沒有明確診斷的疾病綜合征；4、檢測出來的基因變異和患者的疾病本身無關。
在有些情況下，由臨床檢測實驗室提供的CGES中，如果診斷出一個基因中的致病性突變（隱性遺傳疾病時為兩個），并且具有特異性時，便強烈提示該突變相關的遺傳疾病的診斷。實驗室遺傳學者得出的結論是綜合了患者遞交的疾病相關臨床信息和測序后篩選出的突變相關疾病信息而得出[2]。在這種情況下，臨床醫(yī)生都還應該先確認實驗室報告給出的結論是否符合臨床，然后綜合相關醫(yī)學數據資源做出診斷，并告知患者以及患者家屬疾病基因的遺傳率、顯性率、表現型以及預后，以及可能為患者提供的特殊治療。
在其他一些情況下，實驗室提供的CGES報告顯示一個或者多個候選基因變異或者測序結果中的變異并非與當初開具此項檢查時想要檢測的表型相符。此時，如果檢測出來的變異中包含致病性突變，便要查閱大量的文獻和數據庫，從候選的基因變異中篩選出致病性突變。這種測試后的臨床評估方法需要在遺傳學和生物信息學都非常精通的專家完成[16]，因為做好此類評估，不僅要熟悉患者疾病的臨床特征以及鑒定出來變異或者基因的相關表型知識，還需要遺傳學家和疾病專家的共同商討以及他們對患者及其家系的研究。
如果CGES結果陰性，則可能促進某些基因變異在知識水平上更新認識，也就是過去在CGES報告中認為是無法解釋的變異有可能是真正的致病性的突變。到目前為止，雖然對于CGES報告的再分析方法還沒有建立，但是未來仍然應該定期對過去的報告進行再分析以鑒定出過去未知的突變。另外，醫(yī)生要和一個患者家系溝通陰性結果報告很困難，因為患者可能很難接受一個陰性結果的結局，畢竟CGES是一個大范圍篩查的昂貴的檢測項目。此時，最重要是要和患者或者患兒父母溝通說明，即便是一個陰性的CGES報告也不代表排除了致病性突變的可能。如果患者個人或者家系比較明確指向某種特殊的遺傳病，而CGES報告中卻沒有找到引起疾病或者可能引起疾病的突變時，應該和患者解釋，該檢測技術并不是一個可以檢測到疾病相關的所有致病性突變的技術。
5 、意外數據的處理
CGES可以產生一些臨床上有價值但是與原始測序目的不相關的數據，這些結果可以避免患者日后做不必要的檢查。為此，美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會建議，臨床實驗室要常規(guī)提供至少56個基因，24種疾病的特殊突變的查詢和報告[17]。有報道稱在接受CGES檢測的患者中有1~3%會有上述疾病相關的意外突變的發(fā)現[18]。一個具有專業(yè)知識的臨床醫(yī)生在鑒別某個疾病時也需要綜合患者及其家系的其他臨床表現，同時還必須有合適的遺傳咨詢和醫(yī)學服務才能得出結論。
6 、展望
對于很多臨床問題，CGES都是一種非常有價值的診斷方法，正在被臨床遺傳學家和其他的?？漆t(yī)生所應用。我們在本文所列舉的方法和應用都在不斷的更新發(fā)展，臨床的各種疾病綜合征的相關數據越來越多，數據的解釋也在不斷更新改進，CGES也不斷應用在新的臨床領域（如新生兒科）。如果臨床醫(yī)生能夠在測試前和測試后作出很好的評估，同時熟知該檢測的局限性，那么CGES檢測報告價值將發(fā)揮到最大，臨床醫(yī)生也將越來越自信地將該項檢測運用于臨床實踐中，讓更多的患者從中受益。
專家介紹
洪葵 ：留日醫(yī)學博士，留美醫(yī)學博士后，現任南昌大學二級教授，主任醫(yī)師，碩士生/博士生/博士后導師，南昌大學第二附屬醫(yī)院心內科科副主任，心律失常病區(qū)主任，江西省分子醫(yī)學院重點實驗室主任。主要從事心律失常與心肌病的遺傳學基礎和規(guī)范化防治、異常心電圖的機制解析研究。國家百千萬人才領軍人才“萬人計劃”獲得者, 教育部創(chuàng)新團隊帶頭人。發(fā)表論文100余篇。以通訊或第一作者在SCI雜志發(fā)表論文37篇，影響因子累計達110分。
